I SEMIC - Seminário de Iniciação Científica da Unifenas

Semaan, Felipe Silva¹; Coelho, Dulcimara Aparecida²; Faria-e-Silva , Paulo Márcio de³; Franco, Marília Caixeta⁴.

Dentro da família tripanosomatidae encontram-se, entre outros, os gêneros Trypanosoma, Leptomonas, Herpetomonas, Phytomonas, Crithidia e Leishmania, gêneros particularmente importantes por apresentarem interesse médico e econômico, além de servirem como modelos experimentais em diversas áreas de estudo. O presente trabalho tem por objetivo a identificação de isolados de tripanosomatídeos, obtidos no Laboratório de Microbiologia, do Departamento de Ciências Biológicas da EFOA, através do uso da técnica de Splice-leader Polimerase Chain Reaction (SL-PCR). O trabalho vem sendo desenvolvido desde agosto de 2001, no laboratório de Microbiologia e Imunologia da Escola de Farmácia e Odontologia de Alfenas. Foram realizados, concomitantemente, estudos iniciais de biologia molecular, visando padronizar o processo de extração de DNA e as condições sob as quais serão realizadas as reações de PCR, e tentativas de isolamento de espécies de Phytomonas encontradas no látex de Euphorbia pilulifera, coletado e diluído em salina estéril (uma gota de látex para 100ml de salina estéril). Após a coleta e diluição do látex, foram preparadas lâminas que, visualizadas sob aumento de 40x, apresentavam exemplares de protozoários. As amostras infectadas foram inoculadas em meio complexo de Roitman acrescido de 200ml de soro fetal bovino. Com o intuito de reduzir a contaminação e obter culturas axênicas, foram utilizados diversos antibióticos, dentre os quais cefoxitina 30 mg, bacitracina 30 mg, cefotaxima 30 mg, penicilina 30 mg, oxacilina 5 mg, neomicina 30 mg, ciprofloxacina 5 mg, nistatina 100 ml (50 mg/ml) e gentamicina 100ml (0,028 mg/ml). O processo de extração do DNA dos isolados de tripanosomatídeos foi realizado segundo o método da lise alcalina. O produto obtido da extração será submetido a amplificação através de PCR utilizando primers SL1 (- 5' GACTTTCAACTAACGCTAT 3') e SL2 ( - 5' GAAGGTCCCCAGTCTAAAA 3'), sendo, posteriormente, submetido a eletroforese em gel de agarose. Durante as tentativas de isolamento de protozoários a partir de látex infectado melhores resultados foram alcançados através da associação entre ciprofloxacina, neomicina e nistatina, obtendo-se culturas com baixo índice de contaminação por até três semanas, embora ainda não tenha sido obtida uma cultura axênica. Após extração, o DNA genômico obtido foi submetido a eletroforese em gel de agarose 1 % contendo brometo de etídio e fotografado através do flúor-S. Os testes iniciais de amplificação do DNA genômico tiveram como objetivo a otimização da concentração dos primers na reação e da temperatura de anelamento dos mesmos As atividades relacionadas ao isolamento e caracterização molecular dos isolados continuam em andamento, através de novas associações entre antibióticos e antifúngicos. Com relação à biologia molecular, serão realizados novos testes para otimização das condições sob as quais se realizará a amplificação, devendo-se, inicialmente, ajustar a concentração de primer, e também, a temperatura de anelamento.

Palavras-chaves: 1) tripanosomatídeos 2) SL-PCR 3) DNA

¹ Acadêmico do curso de Farmácia - 7º Período - bolsista PIBIC/CNPq/EFOA
² Colaboradora - Acadêmica do curso de Nutrição - 3º Período - EFOA
³ Colaborador - Departamento de Ciências Biológicas - EFOA
⁴ Orientadora - Departamento de Ciências Biológicas - EFOA

Fonte financiadora: PIBIC/CNPq